Spécialité SVT Première et Terminale

Mise en œuvre d’une technique de laboratoire : l’électrophorèse

Deux séquences pédagogiques utilisant l’électrophorèse sont ici proposées :

  • la première séquence propose de déterminer le génotype des individus d’une famille touchée par la drépanocytose afin de déterminer un donneur de moelle osseuse potentiel en lien avec le programme de spécialité en Première.
  • la deuxième séquence propose de déterminer la présence d’un gène de résistance à l’oïdium chez la vigne en lien avec le programme de spécialité en Terminale.
MOTIVATION
Découvrir et mettre en œuvre une technique de laboratoire : l’électrophorèse, et mieux comprendre les documents présentant les résultats obtenus avec cette technique.

Comment mettre en œuvre une électrophorèse en classe et mieux comprendre son principe ?

Focus sur une technique : l’électrophorèse

L’ensemble de la préparation, de la réalisation et de l’observation de l’électrophorèse est réalisable en moins d’1h. L’obtention très rapide de résultats permet la réalisation d’électrophorèses au cours d’une même séance de TP. La possibilité d’observer en direct la migration et de réaliser un time-lapse permet une bonne compréhension du principe de la manipulation.

Afin de préparer cette séance s’appuyant sur plusieurs gestes techniques qui peuvent être difficiles à maîtriser par les élèves, il est possible de s’initier à l’utilisation de la micropipette pour réaliser les dépôts des échantillons d’ADN dans les puits avec l’interface en ligne LabXchange.
NB : Voir l’article de Sébastien Bergeot : L’utilisation de simulateurs virtuels de laboratoire pour s’entrainer aux gestes techniques.

PRINCIPE DE ÉLECTROPHORÈSE
En milieu basique, les molécules d’ADN sont chargées négativement.
Soumises à un champ électrique, elles migrent, dans un gel conducteur, de la cathode (borne négative) vers l’anode (borne positive).

  • L’ADN préalablement soumis à une PCR (Polymerase Chain Reaction) est déposé dans un champ électrique.
  • La taille des fragments obtenus suite à la PCR dépend du nombre de nucléotides (ou paires de bases).
  • La distance parcourue dépend de la taille des fragments exprimée en pdb = nombre de paires de bases = nombre de nucléotides. Plus le fragment est de grande taille, moins il peut migrer rapidement dans le maillage du gel d’agarose.
  • L’utilisation d’un « marqueur de taille » M (solution de fragments d’ADN de tailles connues) permet de déterminer la longueur des fragments d’ADN après leur migration par électrophorèse
Résultat de migration du marqueur de taille M par électrophorèse
marqueur M

Vidéo du protocole d’électrophorèse

Vidéo protocole électrophorèse
Fiche technique générale pour une électrophorèse réalisée avec une cuve de type MiniOne réalisée par Roseline Delcourt et Myriam Benbihi
protocole complet
protocole complet odt
protocole complet pdf
Coût
  • Kit ADN les séquences : coût variable, entre 80 et 120 euros environ
  • Cuve MiniOne : 399 euros (fournisseur : Ecole de l’ADN) ou système équivalent chez Sordalab ou JEULIN, ou bien Flashgel
  • Coupelles Gel Green pour MiniOne : environ 30 euros pour 10 gels

Avantages / Plus-values

  • Permettre aux élèves de s’approprier une méthode de biologie moléculaire de laboratoire, que l’on retrouve fréquemment dans les exercices.
  • Utiliser la micropipette.
  • Utiliser un dispositif d’électrophorèse du coulage du gel aux résultats.

1ère séquence (Première Spécialité SVT) : Détermination du génotype

Professeur expérimentateur

Nathalie ROUSSEAU, au lycée Jeanne d’Albret à Saint-Germain-en-Laye (78)

LIAISON AVEC LE PROGRAMME
Niveau concerné Première Spécialité SVT
Partie du programme CORPS HUMAIN et SANTÉ, Variation génétique et santé
PLACE DANS LA PROGRESSION
L’examen des arbres généalogiques familiaux permet de connaître les modes de transmission héréditaire des déterminants génétiques responsables. L’étude de génomes de grandes cohortes de patients est à la base de l’identification de gènes correspondants. Dans le cas d’une maladie monogénique à transmission autosomique récessive, seuls les homozygotes pour l’allèle muté sont atteints. Les hétérozygotes sont porteurs sains. Selon les cas, les traitements apportés visent à compenser par des médicaments la fonction altérée ou à contrôler les conditions de milieu. Dans certains cas, on peut envisager une thérapie génique visant à remplacer l’allèle muté dans les cellules du tissu atteint.

Cette partie a été traitée plusieurs mois après avoir traité la première partie du programme : "Transmission, variation et expression du patrimoine génétique". Cela permet une réactivation des notions déjà vues en génétique, en l’appliquant ici à la recherche de génotypes dans une famille ici atteinte par la drépanocytose.
Outils numériques et ressources
Genigen2 en ligne
Genigen2
Séquences de la famille
séquence famille drepano
Genially
Interface Genially

Déroulement global de la séquence

Déroulement séquence 1
scenario pedagogique electrophorese
Nathalie ROusseau

Caractéristiques de la séquence

PROBLÈME À RÉSOUDRE
Mise en situation et recherche à mener
Avec 350 000 nouveaux cas diagnostiqués chaque année, la drépanocytose est l’une des maladies génétiques la plus fréquente. Elle concerne ainsi 50 millions de personnes dans le monde.

Un patient atteint d’une forme grave de drépanocytose doit subir une greffe de moelle osseuse. Une analyse génétique au sein de sa fratrie doit être réalisée afin d’identifier un donneur compatible non atteint par la drépanocytose possédant les deux allèles sains du gène codant la chaîne bêta de l’hémoglobine.

NOTIONS, SAVOIR-FAIRE, compétences
Notions Extrait BO n°1 du 22 janvier 2019 – Première Spécialité SVT

  • Recenser, extraire et organiser des informations pour établir l’origine génétique d’une maladie à partir d’arbres généalogiques
  • Prédire les risques génétiques des nouvelles générations en calculant leur probabilité
  • Recenser, extraire et organiser des informations relatives à une maladie génétique monogénique suffisamment fréquente pour que l’on puisse disposer d’un catalogue d’allèles permettant de relier un génotype au phénotype.
  • Recenser, extraire et organiser des informations relatives aux traitements médicaux envisageables en fonction de la variété des manifestations pathologiques observées
Compétences ou Capacités expérimentales
  • Suivre un protocole expérimental, interpréter des résultats
  • Exploiter des informations à partir d’une base de données
  • Exploiter des bases de données pour identifier des mutations
  • Poser un diagnostic génétique par la lecture de résultats de tests génétiques
ACTIVITÉ
Durée :
Préparation du gel : 15 min
Réalisation des dépôts : 15 min
Migration : 30 min
Comparaison séquence Geniegen2 en ligne : 30 min
Exploitation, mise en place 1h
Horaire total : 2 heure
Coût :
 Gel d’agarose 1%TAE (10 coupelles) + Flacon de 100mL de TAE :
APBG Réf : K20MIC : 40 €
 Système électrophorèse MiniOne :
APBG Réf : K20MIS Prix : 399 €
 Electrophorèse d’ADN :
Sordalab Réf : DREPADN Prix : 115,60 € (dans ce kit les séquences sont déjà amplifiées par PCR et digérées par une enzyme de restriction)
Sécurité : Bien respecter les règles de sécurité du branchement des appareils d’électrophorèse
lunettes


Blouse

Déroulement détaillé de la séquence

Proposition de réactivation :
Il est possible de commencer par une réactivation grâce aux documents proposés au début dans cette présentation :

Interface Genially


Cliquez sur l’image ou icipour accéder à l’interface créée avec Genially.

L’élève pourra ainsi réinvestir les notions déjà vues plus tôt dans l’année de génotype et de différentes échelles du phénotype, ici concernant la drépanocytose. Il est proposé de retrouver la différence entre les séquences des allèles HbA (sain) et HbS (muté) grâce à un lien renvoyant vers Geniegen2.

Il est ensuite possible de continuer à utiliser l’animation, qui peut également être une alternative pour un travail réalisé à distance. L’animation permet également d’aborder d’autres thérapies envisageables pour traiter cette maladie comme la thérapie génique.
Voici une description de la démarche utilisée en classe.

1ère partie : Analyse Arbre généalogique de la famille du patient

On cherche tout d’abord à déterminer les génotypes du patient et de ses parents à partir d’un arbre généalogique. On peut ensuite réaliser un échiquier de croisement pour déterminer quels sont les génotypes possibles des frères et sœurs du patient afin de déterminer la probabilité qu’un membre de sa fratrie aient deux versions saines de l’allèle impliqué dans la drépanocytose. C’est cet individu qui pourra être un donneur de moelle osseuse potentiel.

Voici l’arbre généalogique de la famille étudiée :

Arbre généalogique

Le fichier de séquences comporte la séquence de l’allèle HBA et HBS, puis les allèles du patient. La séquence des parents est déduite grâce à l’analyse de l’arbre puis peut-être vérifiée grâce au fichier de séquences.

séquence famille drepano

On détermine alors que les deux parents sont hétérozygotes (HbA//HbS) alors que le patient a deux copies de l’allèle muté (HbS//HbS) expliquant ses symptômes.

2ème partie : Réalisation de l’électrophorèse en classe

Suite à une prise de sang, l’ADN du patient et de ses frères et sœurs a été extrait puis amplifié par PCR. On réalise alors en classe une électrophorèse pour déterminer les génotypes du patient et sa fratrie.
Pour comprendre l’origine des fragments obtenus sur le gel, il est possible de faire réfléchir les élèves sur le rôle des enzymes de restriction. Il est toutefois aussi possible d’indiquer directement aux élèves à quels allèles correspondent les fragments obtenus et de les faire alors travailler sur les résultats attendus.

Une enzyme de restriction est utilisée pour couper l’ADN étudié en plusieurs fragments, ce qui va permettre de différencier les allèles sain et muté.
On utilise lors de cette digestion enzymatique l’enzyme DDEL. Elle a la propriété de couper les deux brins d’ADN selon le schéma ci-dessous.

Autre possibilité : un parcours ELEA est proposé pour comprendre les enzymes de restriction dans l’article l’utilisation de simulateurs virtuels de laboratoire pour s’entrainer aux gestes techniques

site de restriction

N désigne n’importe quel nucléotide A, C, T ou G
Afin de déterminer le nombre de fragments obtenus suite à la digestion par l’ensemble, on peut demander aux élèves de recopier le début de la séquence de l’allèle sain jusqu’au 25ème nucléotide grâce à la séquence observée à l’aide de Geniegen2. On peut réinvestir les notions déjà vues sur l’ADN en faisant écrire le brin complémentaire. Enfin, les élèves doivent placer correctement le site de coupure de l’enzyme.

  • Dans le cas de l’allèle sain, un site de coupure est identifié. On obtient ainsi deux fragments d’ADN.
  • Dans le cas de l’allèle muté, aucun site n’est identifié par l’enzyme de restriction. On obtient alors un seul fragment.

On peut alors demander aux élèves le nombre de fragments obtenus dans le cas où l’individu est homozygote (HbS//HBS) et (HbA//HbA), ainsi que si l’individu est hétérozygote (HbA//HbS).

Remarque : En réalité, l’ADN analysé ne commence par au début du gène, ce qui explique que la taille des fragments n’est pas la même que ceux obtenus lors du raisonnement précédent.

Fiche préparation labo Fiche protocole élève Protocole complet
Fiche labo
fiche labo odt
fiche labo pdf
protocole eleve
protocole odt
protocole pdf
protocole complet
protocole complet odt
protocole complet pdf
Exemple de résultat obtenu après migration
Résultats électrophorèse

Vidéo des résultats de la migration

vidéo time laps
Conclusion :


Grâce au gel, on détermine ainsi que la sœur I-1 est un donneur possible pour la greffe.

Note : il faudra aussi vérifier la compatibilité HLA du patient pour pouvoir valider la greffe, mais cet aspect n’est pas traité ici.

2ème séquence (Terminale Spécialité SVT) : Détermination du génotype d’un pied de vigne, recherche de la présence du gène de résistance à l’oïdium

Professeur expérimentateur

Amaury TAVERNIER, au lycée Jeanne d’Albret à Saint-Germain-en-laye (78)

LIAISON AVEC LE PROGRAMME
Niveau concerné Terminale Spécialité SVT
Partie du programme La domestication des plantes
PROBLÈME À RÉSOUDRE
Comment mettre au point une variété résistante de vigne, qui contient un gène de résistance à l’Oïdium Run1 et qui peut être exploitable économiquement ?

Déroulement global de la séquence

Déroulement séquence 2
scenario_peda_electrophorese_vigne

Caractéristiques de la séquence

NOTIONS, SAVOIR-FAIRE, compétences
Notions Extrait du Bulletin officiel spécial n° 8 du 25 juillet 2019 :
Les pratiques culturales (par exemple pour la production de graines) constituent un enjeu majeur pour nourrir l’humanité.
La sélection (empirique ou programmée) exercée par l’être humain sur les plantes cultivées au cours des siècles a retenu des caractéristiques différentes de celles qui étaient favorables à leurs ancêtres sauvages. Cette sélection s’est opérée au cours de l’établissement d’une relation mutualiste entre plantes et êtres humains.
Aujourd’hui, de nombreuses techniques favorisent la création de plus en plus rapide de nouvelles variétés végétales (par hybridation, par utilisation des biotechnologies...). La production de semences commerciales est devenue une activité spécialisée.
Une espèce cultivée présente souvent de nombreuses variétés (forme de biodiversité). Cette diversité résulte de mutations dans des gènes particuliers. L’étude des génomes montre un appauvrissement global de la diversité allélique lors de la domestication. La perte de certaines caractéristiques des plantes sauvages (comme des défenses chimiques ou des capacités de dissémination) et l’extension de leur culture favorisent le développement des maladies infectieuses végétales. Ces fragilités doivent être compensées par des pratiques culturales spécifiques. L’exploitation des ressources génétiques (historiques ou sauvages si elles existent) permet d’envisager de nouvelles méthodes de cultures (réduction de l’usage des intrants, limitation des ravageurs par lutte biologique).
La domestication des plantes, menée dans différentes régions du monde, a eu des conséquences importantes dans l’histoire des populations humaines. Elle a contribué à la sélection de caractères génétiques humains spécifiques.
Compétences ou Capacités expérimentales
  • Identifier la diversité biologique de certaines plantes cultivées
  • Comprendre les enjeux de société relatifs à la production des semences.
  • Conduire un projet pour suivre une culture de semences commerciales sur plusieurs générations, en prévoyant un protocole de comparaison des productions obtenues.
  • Identifier des caractères favorisés par la domestication (taille, rendement de croissance, nombre des graines, précocité, déhiscence, couleur...)
ACTIVITÉ
Durée : 2h
Préparation du gel : 15 min
Réalisation des dépôts : 15 min
Migration : 30 min
Déterminer les caractéristiques des cépages : 45 min
Réalisation du compte rendu final : 15 min
Horaire total : 2 heure
Coût :
 Gel d’agarose 1%TAE (10 coupelles) + Flacon de 100mL de TAE :
APBG Réf : K20MIC : 40 €
 Système électrophorèse MiniOne :
APBG Réf : K20MIS Prix : 449 €
 Électrophorèse d’ADN APBG école de l’ADN :
Génome des plantes cultivées et biodiversité
K12PLA, 77 €
Sécurité : Bien respecter les règles de sécurité du branchement des appareils d’électrophorèse
lunettes


Blouse

Déroulement détaillé de la séquence

La domestication de la vigne et résistance de la Vigne à l’Oïdium

Un peu d’histoire :
On sait que le raisin est consommé depuis le Mésolithique (10 000 av. J.C.) par les populations du bassin méditerranéen. Il est plus difficile de dire à quand remontent la culture de la vigne et sa domestication (la domestication impliquant la modification du végétal par l’Homme, qui en sélectionne les caractères les plus intéressants).

Histoire de la domestication et de la création variétale de la vigne

Les plantes cultivées sont issues de plantes sauvages. Parmi la grande diversité des variétés sauvages, l’agriculteur a repéré et choisi un certain nombre de caractères favorables à la culture et à la récolte.

Vitis vinifera

Ainsi, pour les vignes ont été sélectionnées les variétés qui réalisaient plus de réserves dans les baies et qui possédaient plus de saveur ou des couleurs différentes.

Ainsi, trois principaux types de variétés ont été créés :

  • Les raisins secs possèdent des baies très petites, plus faciles à sécher,
  • Les raisins de cuve possèdent petites baies et petites grappes, afin d’extraire un maximum de composés importants pour la qualité du vin,
  • Les raisins de table possèdent de grosses baies, grappes plus grandes et caractères gustatifs de diversification (teneur en sucre, arômes, couleurs…).

Cette méthode empirique de sélection consistant à repérer au sein d’une population les individus possédant les qualités que l’on recherche et à les utiliser pour la reproduction, porte le nom de sélection phénotypique ou sélection massale.

Aujourd’hui, les vignes sont reproduites essentiellement par greffage. En effet, elles ont été atteintes par un insecte, le Phylloxera qui parasitait les racines. Il s’est avéré que des vignes américaines (dont la qualité en raisin était inférieure) n’étaient atteintes par le Phylloxera qu’au niveau des feuilles.

Ainsi sont utilisées comme porte-greffe, des vignes américaines (Vitis rupestris et Vitis labrusca) dont les racines sont résistantes et comme greffons des variétés de vigne française (Vitis vinifera) aux qualités de raisin reconnues.

Création d’une variété résistante à un pathogène : l’oïdium de la vigne

L’Oïdium est un champignon parasite de la Vigne.

Baie de raisin recouverte du mycelium de l’oidium (INRAE)

Il est visible sur les feuilles sous la forme d’un feutrage blanc : les filaments mycéliens.
L’oïdium est une maladie encore mal connue. Peu visible à ses débuts, difficile à contrôler une fois installée, son impact peut être considérable aussi bien en termes de rendement que de qualité.
Le coût engendré par les traitements restant élevé, vous êtes chargé de la mise au point d’une variété résistante, qui contient un gène de résistance à l’Oïdium : Run1, mais qui peut être exploitable économiquement.

Le gène Run1 est présent chez l’espèce Muscadinia rotundifolia, Espèce originaire du sud des Etats-Unis, peu productive mais résistante à l’Oïdium. Cette espèce possède le gène Run1.

On note (R//R) son génotype.

Vitis vinifera est une espèce productive mais non résistante à l’Oïdium. Cette espèce ne possède pas le gène Run1.

On notera (r//r) son génotype

Vitis vinifera est à l’origine de centaines de variétés, obtenues en culture par sélection : les cépages.

En tant que chercheur vous allez réaliser plusieurs cycles de croisements entre un hybride (R//r) avec le parent (r//r).

À chaque cycle, ne sont conservés que des individus porteurs de la résistance pour le croisement suivant. Ce procédé permet d’éliminer en moyenne la moitié du génome sauvage résiduel à chaque génération, hormis la fraction porteuse de la résistance.

Premier croisement : Vitis vinifera (r//r) x Muscadinia rotondifolia (R//R)
croisement Vitis vinifera et Muscadinia rotondifolia
Croisements successifs de l’hybride (R//r) avec le parent (r//r).
Croisement successif d’hybride
Pour réaliser votre mission :
Vous souhaitez vérifier que l’hybride de deuxième génération obtenu est bien porteur de la résistance, afin de le croiser à nouveau avec la variété sélectionner de Vitis vinifera .

Vous devez déterminer des caractéristiques intéressantes de plusieurs cépages de Vitis vinifera afin de sélectionner le parent à croiser avec Muscadinia rotondifolia

Expliquer notamment les caractéristiques de chaque cépage mis à disposition et comment, grâce à la technique de l’électrophorèse, on peut déterminer que les hybrides obtenues possèdent bien le gène Run 1.

Puis présenter, sous la forme d’un schéma, les résultats attendus suite à l’électrophorèse :
 dans le cas d’un hybride possédant le gène de résistance
 dans le cas d’un individu n’ayant pas reçu le gène de résistance
PRINCIPE DE ÉLECTROPHORÈSE

En milieu basique, les molécules d’ADN sont chargées négativement.
Soumises à un champ électrique, elles migrent, dans un gel conducteur, de la cathode (borne négative) vers l’anode (borne positive).
  La distance parcourue dépend de la taille des fragments.
  taille du gène Run1 qui confère la résistance à l’oïdium = 400 pdb
  taille du gène VMC spécifique de Vitis infera = 900 pdb
(*) pdb = nombre de paires de bases = nombre de nucléotides.
  L’utilisation d’un « marqueur de taille » M (solution de fragments d’ADN de tailles connues) permet de déterminer la longueur des fragments d’ADN après leur migration par électrophorèse

Protocole de l’électrophorèse sur gel d’agarose de la vigne
protocole_electrophorese_vignes_complet
protocole_electrophorese_vignes_complet odt
protocole_electrophorese_vignes_complet pdf

Les élèves sont amenés à réaliser un préparation du gel d’agarose pour l’électrophorèse, puis à réaliser des dépôts pour déterminer ou non la présence du gène Run1 sur les hybrides réalisés.

Ils déposent donc un marqueur de charge, un témoin positif avec les gènes Run1 et VMC, puis un témoin négatif ne comprenant que le gène VMC, enfin les échantillons d’hybrides de deuxième génération F2 réalisés qui seront à déterminer pour la présence du gène Run1 et VMC (lors de la préparation avant le TP, plusieurs Eppendorf avec des numéros sont préparés avec des échantillons aléatoirement choisis entre présence ou absence du gène d’intérêt. On peut d’ailleurs, présenter la proportion d’individus obtenue lors de ce croisement).

prelevement

Pendant la préparation et la migration, les élèves vont observer, réaliser une dissection d’une baie, goûter et déterminer les caractéristiques de plusieurs cépages de Vitis vinifera afin de choisir la variété qui sera hybridée avec Muscadinia rotondifolia.

raisin
grappe
cépages raisins

Les échantillons contenant les gènes Run1 et VMC seront de bons candidats pour continuer les hybridations successives afin d’obtenir une variété de vigne résistante à l’oïdium et présentant les caractéristiques d’intérêts gustatifs et économiques.

Résultats d’électrophorèse
photo resultats
photo resultats electrophorèse de vigne légendé

Vidéo de la migration

Video migration vigne

Retours, analyse et pistes d’amélioration

RETOUR DES IMPRESSIONS DES ÉLÈVES
  • Élèves motivés par l’usage de matériel de laboratoire.
  • Mise en relation avec des éléments concrets.
  • Dégustation des différents cépages pour le TP sur la vigne.
ANALYSE ET ÉVALUATION DU DISPOSITIF
Plus-values dégagées Les élèves maîtrisent l’ensemble de l’expérience depuis le coulage du gel jusqu’à la migration. Ils apprécient pouvoir observer en temps réel la migration du gel où il est possible d’observer la séparation des fragments d’ADN.

Séquence Première :

  • Réinvestissement des notions en génétique en réalisant une expérience.
  • Découverte d’une micropipette et de l’électrophorèse.



Séquence Terminale :

  • Les élèves réutilisent une technique réalisée en Première.
  • Ils mettent en relation les notions et les observations concrètes de la variété des cépages issus de la domestication de la vigne.
  • Ils peuvent réutiliser les notions de génétique et de reproduction des plantes.
Difficultés rencontrées Pour les deux séquences :

  • Les élèves ont des difficultés à réaliser les dépôts dans les puits (ils ré-aspirent souvent les échantillons en utilisant maladroitement la micropipette ou ne déposent pas précisément dans le puits).
  • Les fragments obtenus sont alors trop diffus ou trop petits pour être correctement observés.



Pour la séquence sur la vigne :

  • Toutes les périodes ne sont pas propices à l’obtention de cépages intéressants, privilégier/septembre octobre ou mai/juin.
  • Pour les autres périodes ce sera des cépages provenant d’Afrique du Sud, d’Australie ou du Chili.
Pistes d’amélioration Préparer le TP en amont et à distance, notamment pour préparer l’apprentissage du geste avec une micropipette virtuelle (voir l’article de S. Bergeot)

Remerciements à Roseline Delcourt et Myriam Benbihi pour leur aide précieuse dans la réalisation des protocoles et des vidéos, Mélanie Fenaert pour la trame du Genially, ainsi que Marie Couty et Carole Mongazon et aux élèves des classes 112 et T9 du lycée Jeanne d’Albret

Partager

Imprimer cette page (impression du contenu de la page)