Proposition de réactivation :

Il est possible de commencer par une réactivation grâce aux documents proposés au début dans cette présentation : Cliquez sur l’image ou icipour accéder à l’interface créée avec Genially. L’élève pourra ainsi réinvestir les notions déjà vues plus tôt dans l’année de génotype et de différentes échelles du phénotype, ici concernant la drépanocytose. Il est proposé de retrouver la différence entre les séquences des allèles HbA (sain) et HbS (muté) grâce à un lien renvoyant vers Geniegen2.

Il est ensuite possible de continuer à utiliser l’animation, qui peut également être une alternative pour un travail réalisé à distance. L’animation permet également d’aborder d’autres thérapies envisageables pour traiter cette maladie comme la thérapie génique.
Voici une description de la démarche utilisée en classe.

On cherche tout d’abord à déterminer les génotypes du patient et de ses parents à partir d’un arbre généalogique. On peut ensuite réaliser un échiquier de croisement pour déterminer quels sont les génotypes possibles des frères et sœurs du patient afin de déterminer la probabilité qu’un membre de sa fratrie aient deux versions saines de l’allèle impliqué dans la drépanocytose. C’est cet individu qui pourra être un donneur de moelle osseuse potentiel.

Voici l’arbre généalogique de la famille étudiée :

Le fichier de séquences comporte la séquence de l’allèle HBA et HBS, puis les allèles du patient. La séquence des parents est déduite grâce à l’analyse de l’arbre puis peut-être vérifiée grâce au fichier de séquences.

On détermine alors que les deux parents sont hétérozygotes (HbA//HbS) alors que le patient a deux copies de l’allèle muté (HbS//HbS) expliquant ses symptômes.

Suite à une prise de sang, l’ADN du patient et de ses frères et sœurs a été extrait puis amplifié par PCR. On réalise alors en classe une électrophorèse pour déterminer les génotypes du patient et sa fratrie.
Pour comprendre l’origine des fragments obtenus sur le gel, il est possible de faire réfléchir les élèves sur le rôle des enzymes de restriction. Il est toutefois aussi possible d’indiquer directement aux élèves à quels allèles correspondent les fragments obtenus et de les faire alors travailler sur les résultats attendus.

Une enzyme de restriction est utilisée pour couper l’ADN étudié en plusieurs fragments, ce qui va permettre de différencier les allèles sain et muté.
On utilise lors de cette digestion enzymatique l’enzyme DDEL. Elle a la propriété de couper les deux brins d’ADN selon le schéma ci-dessous.

Autre possibilité : un parcours ELEA est proposé pour comprendre les enzymes de restriction dans l’article l’utilisation de simulateurs virtuels de laboratoire pour s’entrainer aux gestes techniques

N désigne n’importe quel nucléotide A, C, T ou G
Afin de déterminer le nombre de fragments obtenus suite à la digestion par l’ensemble, on peut demander aux élèves de recopier le début de la séquence de l’allèle sain jusqu’au 25ème nucléotide grâce à la séquence observée à l’aide de Geniegen2. On peut réinvestir les notions déjà vues sur l’ADN en faisant écrire le brin complémentaire. Enfin, les élèves doivent placer correctement le site de coupure de l’enzyme.

• Dans le cas de l’allèle sain, un site de coupure est identifié. On obtient ainsi deux fragments d’ADN.

• Dans le cas de l’allèle muté, aucun site n’est identifié par l’enzyme de restriction. On obtient alors un seul fragment.

On peut alors demander aux élèves le nombre de fragments obtenus dans le cas où l’individu est homozygote (HbS//HBS) et (HbA//HbA), ainsi que si l’individu est hétérozygote (HbA//HbS).

Remarque : En réalité, l’ADN analysé ne commence par au début du gène, ce qui explique que la taille des fragments n’est pas la même que ceux obtenus lors du raisonnement précédent.

Fiche préparation labo	Fiche protocole élève	Protocole complet

Vidéo des résultats de la migration

Grâce au gel, on détermine ainsi que la sœur I-1 est un donneur possible pour la greffe.
Note : il faudra aussi vérifier la compatibilité HLA du patient pour pouvoir valider la greffe, mais cet aspect n’est pas traité ici.

Un peu d’histoire :
On sait que le raisin est consommé depuis le Mésolithique (10 000 av. J.C.) par les populations du bassin méditerranéen. Il est plus difficile de dire à quand remontent la culture de la vigne et sa domestication (la domestication impliquant la modification du végétal par l’Homme, qui en sélectionne les caractères les plus intéressants).

Histoire de la domestication et de la création variétale de la vigne

Les plantes cultivées sont issues de plantes sauvages. Parmi la grande diversité des variétés sauvages, l’agriculteur a repéré et choisi un certain nombre de caractères favorables à la culture et à la récolte.

Ainsi, pour les vignes ont été sélectionnées les variétés qui réalisaient plus de réserves dans les baies et qui possédaient plus de saveur ou des couleurs différentes.

Ainsi, trois principaux types de variétés ont été créés :

• Les raisins secs possèdent des baies très petites, plus faciles à sécher,
• Les raisins de cuve possèdent petites baies et petites grappes, afin d’extraire un maximum de composés importants pour la qualité du vin,
• Les raisins de table possèdent de grosses baies, grappes plus grandes et caractères gustatifs de diversification (teneur en sucre, arômes, couleurs…).

Cette méthode empirique de sélection consistant à repérer au sein d’une population les individus possédant les qualités que l’on recherche et à les utiliser pour la reproduction, porte le nom de sélection phénotypique ou sélection massale.

Aujourd’hui, les vignes sont reproduites essentiellement par greffage. En effet, elles ont été atteintes par un insecte, le Phylloxera qui parasitait les racines. Il s’est avéré que des vignes américaines (dont la qualité en raisin était inférieure) n’étaient atteintes par le Phylloxera qu’au niveau des feuilles.

Ainsi sont utilisées comme porte-greffe, des vignes américaines (Vitis rupestris et Vitis labrusca) dont les racines sont résistantes et comme greffons des variétés de vigne française (Vitis vinifera) aux qualités de raisin reconnues.

L’Oïdium est un champignon parasite de la Vigne.

Il est visible sur les feuilles sous la forme d’un feutrage blanc : les filaments mycéliens.
L’oïdium est une maladie encore mal connue. Peu visible à ses débuts, difficile à contrôler une fois installée, son impact peut être considérable aussi bien en termes de rendement que de qualité.
Le coût engendré par les traitements restant élevé, vous êtes chargé de la mise au point d’une variété résistante, qui contient un gène de résistance à l’Oïdium : Run1, mais qui peut être exploitable économiquement.

Le gène Run1 est présent chez l’espèce Muscadinia rotundifolia, Espèce originaire du sud des Etats-Unis, peu productive mais résistante à l’Oïdium. Cette espèce possède le gène Run1.

On note (R//R) son génotype.

Vitis vinifera est une espèce productive mais non résistante à l’Oïdium. Cette espèce ne possède pas le gène Run1.

On notera (r//r) son génotype

Vitis vinifera est à l’origine de centaines de variétés, obtenues en culture par sélection : les cépages.

En tant que chercheur vous allez réaliser plusieurs cycles de croisements entre un hybride (R//r) avec le parent (r//r).

À chaque cycle, ne sont conservés que des individus porteurs de la résistance pour le croisement suivant. Ce procédé permet d’éliminer en moyenne la moitié du génome sauvage résiduel à chaque génération, hormis la fraction porteuse de la résistance.

En milieu basique, les molécules d’ADN sont chargées négativement.
Soumises à un champ électrique, elles migrent, dans un gel conducteur, de la cathode (borne négative) vers l’anode (borne positive).
–  La distance parcourue dépend de la taille des fragments.
–  taille du gène Run1 qui confère la résistance à l’oïdium = 400 pdb
–  taille du gène VMC spécifique de Vitis infera = 900 pdb
(*) pdb = nombre de paires de bases = nombre de nucléotides.
–  L’utilisation d’un « marqueur de taille » M (solution de fragments d’ADN de tailles connues) permet de déterminer la longueur des fragments d’ADN après leur migration par électrophorèse

Protocole de l’électrophorèse sur gel d’agarose de la vigne

Les élèves sont amenés à réaliser un préparation du gel d’agarose pour l’électrophorèse, puis à réaliser des dépôts pour déterminer ou non la présence du gène Run1 sur les hybrides réalisés.

Ils déposent donc un marqueur de charge, un témoin positif avec les gènes Run1 et VMC, puis un témoin négatif ne comprenant que le gène VMC, enfin les échantillons d’hybrides de deuxième génération F2 réalisés qui seront à déterminer pour la présence du gène Run1 et VMC (lors de la préparation avant le TP, plusieurs Eppendorf avec des numéros sont préparés avec des échantillons aléatoirement choisis entre présence ou absence du gène d’intérêt. On peut d’ailleurs, présenter la proportion d’individus obtenue lors de ce croisement).

Pendant la préparation et la migration, les élèves vont observer, réaliser une dissection d’une baie, goûter et déterminer les caractéristiques de plusieurs cépages de Vitis vinifera afin de choisir la variété qui sera hybridée avec Muscadinia rotondifolia.

Les échantillons contenant les gènes Run1 et VMC seront de bons candidats pour continuer les hybridations successives afin d’obtenir une variété de vigne résistante à l’oïdium et présentant les caractéristiques d’intérêts gustatifs et économiques.

Vidéo de la migration