L'hybridation in situ d'ADN (HIS ou ISH pour «In Situ Hybridization») ,
est une technique qui permet de mettre en évidence et de localiser, dans
des cellules ou des tissus, des séquences d'acides nucléiques connues.
L' hybridation in situ fait appel à deux propriétés de la molécule d'ADN,
à savoir la possibilité de la dénaturer c'est à dire de séparer les deux
hélices la constituant d'une part et, d'autre part, la complémentarité des
bases des deux brins et leur tendance à se réassocier lorsqu'ils sont
séparés.
La dénaturation permet d'obtenir des molécules monocaténaires ou simples
brins qui auront tendance à se réassocier une fois replacées dans des
conditions physiologiques.
Si des molécules d'ADN dénaturées sont placées dans un milieu contenant des
molécules simple brin d'ADN ou d'ARN de séquence connue, celles-ci auront
tendance à s'associer avec les portions des ADN dénaturés qui leur sont
complémentaires.
Cette méthode repose donc, comme les Southern et Northern blots, sur l'hybridation d'une molécule simple brin d'ADN (sonde) avec une séquence complémentaire, dénaturée, de préparation cytologique (chromosomes métaphasiques ou noyaux interphasiques).
Le principal intérêt de l'HIS est qu'elle s'effectue sur une coupe histologique de tissu, apportant ainsi des informations précises sur la localisation des acides nucléiques étudiés (les Southern et Northern blots se faisant sur des broyats de tissus).
Les sondes utilisées sont le plus souvent de l'ADN (double brin ou plus rarement monobrin) ou un ARN-messager (riboprobes) ou des oligonucléotides synthétiques (de 20 à 50 nucléotides). Pour pouvoir être visualisées, ces sondes doivent être préalablement marquées. On distingue donc quatre types de marquages:
|
Marquage |
Révélation |
| Isotopes radioactifs (tritium H3, P32 ou S35). | Autoradiographie |
| Produits fluorescents, on parle alors de FISH; | Microscopie à fluorescence |
|
Haptènes: |
Avidine et streptavidine Anticorps marqués par un enzyme |
| Enzymes (p.e. phosphatase alcaline) | Anticorps ou chromogènes |
L'HIS est également réalisable en microscopie électronique en utilisant un marquage à l'or colloïdal avec plusieurs tailles de grains possibles (0.8 à 20 nm).