I. Les différents types de sondes et les utilisations en cytogénétique.
II. Autres utilisations: diagnostic et comparaison de caryotypes
Les techniques
d'hybridation in situ
(retour)
Les scientifiques utilisent trois types différents de sondes de FISH, chacune ayant une application différente:
| Caryotypage: numération et identification des chromosomes homologues. |
Les sondes centromériques répétées sont engendrées à
partir de séquences consensus trouvées aux centromères des chromosomes.
Chaque sonde pouvant être colorée par un fluochrome différent, il est alors
possible de déterminer si un individu a un nombre correct de chromosomes ou,
par exemple, si une personne a une copie supplémentaire d'un chromosome.
L'inconvénient de ces sondes est qu'elles sont inefficaces dans la détection
d'un certain nombre aberrations chromosomiques comme les translocations et les
délétions impliquant les bras des chromosomes.
| La localisation de gène |
Dès lors qu'un gène est identifié et séquencé, il
est possible de synthétiser les sondes correspondantes. Ces sondes
peuvent alors être utilisées afin de déterminer sur quel chromosome ce
gène est localisé.
Cette même technique peut être utilisée pour identifier des translocations
connues ou même des inversions.
| Analyse des chromosomes |
Cet utilisation nécessite de posséder une collection de sondes pour chaque chromosome, chacune de ces sondes s'hybridant avec une séquence précise du chromosome. Utilisant ces bibliothèques de sondes, les scientifiques peuvent colorer un chromosome entier et produisent ainsi un caryotype spectral leur permettant d'identifier des anomalies chromosomiques, par exemple, quand un morceau d'un chromosome est attaché à la fin d'un autre chromosome (translocations inconnues).
D'un point de vue clinique, la technique FISH peut-être utilisée en diagnostic prénatal soit à partir de cellules fœtales prélevées par amniocentèse, soit à partir de cellules du placenta ou encore lors de fécondation in vitro à partir d'une cellule embryonnaire (stade 8 cellules).
Enfin, des sondes d'ADN humain peuvent être hybridée avec des chromosomes d'autres espèces permettant ainsi d'étudier les homologies et de proposer des hypothèses quant à l'évolution des caryotypes (phylogénie).
La technique consiste en 4 étapes:
| Préparation des sondes d'ADN et marquage des sondes, |
| Préparation des spécimens cytologiques et dénaturation des sondes et des brins d'ADN, |
| Hybridation in situ |
| Détection de la fluorescences des sondes et visualisation par microscopie à épifluorescence |
Le marquage est en général effectué par des enzymes (PCR, terminal transferase...). Pendant la réaction de marquage des nucléotides modifiés sont incorporés permettant la fixation des fluochromes. Récemment, des nucléotides directement conjugués aux fluochromes ont été mis au point (FITC-dUTP, TRIC-dUTP).
La dénaturation des sondes et des spécimens se fait par chauffage et addition de formamide pour réduire la température de dénaturation de l'ADN double brin.
L'hybridation se fait à 37°C pendant 16 heures. Ce temps peut-être
diminué lorsque les cibles sont des séquences répétées ou augmenté pour
l'hybridation de sondes particulières avec leur cibles spécifiques ou quand le
génome entier est hybridé (comparative genomic hybridization, CGH).
La détection indirecte est effectuée avec des fluochromes liés à
l'avidine ou à des anticorps spécifiques dirigés contre les dUTP. En
détection directe, l'utilisation de nucléotides marqués (dUTP marqué avec
des fluochromes) rend cette étape inutile sauf si une amplification est
nécessaire (amplification immunologique avec des anticorps marqués au
fluochrome dirigés contre le fluochrome lié au dUTP, par exemple FITC
conjugué avec des anti-FITC de lapin).
|
Fluochromes |
Couleur |
|
AMCA, Cascade blue |
bleu | |
| FITC | vert | |
| TRITC, Texas Red, Rhodamine, Cy3 | rouge | |
| Ultralite 680 ou Cy5 | IR |
Pour affiner l'analyse FISH, un marquage multiple peut-être effectué sur
les sondes ce qui permet d'augmenter le nombre de régions cibles discernables
au moyen de leur coloration.
Par exemple avec trois fluochromes, 7 sondes peuvent être distinguées: sondes
1 à 3, un seul fluochrome, la sonde 4 FITC et TRITC, 5 FITC et AMCA, 6 TRITC et
AMCA et 7 FITC, TRITC et AMCA.
Un aspect important dans l'analyse des chromosomes colorés par FISH est la notion de résolution.
Sur les chromosomes métaphasiques, la taille des sondes est d'au minimum 500bp il n'est donc pas possible de visualiser des évènements affectant des séquences de taille inférieure.