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Etude de la paroi pecto-cellulosique végétale par "ablation" moléculaire

Niveau : Première S
Partie du programme: "Des phénotypes à différents niveaux d'organisation du vivant" "Génotype, phénotype et morphogenèse de la plante"

Problématique: après avoir vu que la croissance d'un végétal se faisait par division cellulaire et élongation, on peut se demander quels sont les constituants de la plante qui lui confèrent la double propriété de cohésion cellulaire et de cadre cellulaire.

L'utilisation d'enzymes spécifiques des différents constituants pariétaux va permettre non seulement de réinvestir les acquis sur le mode d'action des enzymes (plus particulièrement la spécificité de substrat) mais aussi de mettre en évidence la fonction de ces différents constituants.
En effet, la pectinase par son action hydrolytique sur le constitutant majoritaire de la lamelle moyenne va mettre en évidence le rôle cohésif de cette structure. Les cellules gardant leur cadre rigide cellulosique
D'autre part, l'action de la cellulase (plus difficile à mettre en évidence ) ne permet pas de séparer le cellules (la lamelle moyenne restant présente).
Enfin, l'action conjuguée des deux enzyme permet d'obtenir des cellules végétales isolées et sphériques : les Protoplastes.

Protocole expérimental.

Solution 1

  • Pour 100 ml de tampon phosphate 10 mM à pH 5,8
  • 0,2 g de macérozyme Onozuka
  • 10 g de mannitol (0,6 M)

Préparation du tampon phosphate :
- réaliser une solution de NaH2PO4 à 0,2 M (solution A) et une solution de Na2HPO4 à 0,2 M (solution B);
- mélanger : 4,6 ml de solution A, 0,4 ml de solution B, 95 ml d'eau

Solution 2

  • Pour 100 ml de tampon phosphate 10 mM à pH 5,8
  • 0,2 g de cellulase Onozuka
  • 10 g de mannitol (0,6 M)

Solution 3

  • Pour 100 ml de tampon phosphate 10 mM à pH 5,8
  • 0,2 g de macérozyme Onozuka
  • 0,2 g de cellulase Onozuka
  • 10 g de mannitol (0,6 M)

PS: les enzymes sont chers mais l'on peut conserver les solutions au congélateur.

Préparation du matériel biologique

  • Faire des lamelles tangentielles fines dans une feuille de poireau et plonger les lamelles immédiatement dans les différentes solutions en prenant soin de placer la face sectionnée vers la solution.

Incubation

Les boites de pétri sont placées à 30°C pendant une heure.

Observation

On peut prélever les lamelles incubées avec une pince fine et les tapoter sur la lame. On peut alors observer dans une goutte de la solution d'incubation.

 

Cellules dans solution 1

La présence de pectinase a permis la digestion de la lamelle moyenne et donc la séparation des cellules mais la présence de la partie cellulosique de la paroi maintient un certain cadre à la cellule.

Cellules dans solution 2

La présence de cellulase dans la solution a permis la digestion de la partie cellulosique de la paroi mais la lamelle moyenne, encore présente, cimente les cellules végétales.

Cellules dans solution 3

La présence dans la solution de cellulase et de pectinase (macerozyme) permet une digestion totale de la paroi et le formation de protoplastes

Où trouver les produits?

cellulase Onozuka R10 ref : 16419.02
macérozyme Onozuka R10 ref : 28302.02
SERVA, distribué par COGER, 79 rue des Morillons 75015 Paris Tel : 01 45 33 67 17

Informations complémentaires
Sur le site Vie
Sur le site BIOTIC.(très bientôt)

Auteur : alain Pothet